真皮替代物和活性皮肤替代物的三维培养模型 ， 对研究细胞的生长、分化、增生及真表皮间的相互作用有重要意义 ， 也是研制大面积创面覆盖物——复合皮的一条重要途径［1］ 。
文章插图
一、材料与方法
1.胶原：实验所用胶原为酸溶性鼠尾胶原 ， 参照文献［2］的方法稍有改良进行提取 ， 并用751紫外分光光度计测蛋白浓度为1.0～1.5mg/ml 。
2.包皮成纤维细胞培养：应用组织块培养法进行正常包皮成纤维细胞原代培养 。培养基为10%新生牛血清dmem ， 每3天换液1次 。3～4周后原代培养细胞生长成细胞单层 ， 用0.25%胰蛋白酶消化后 ， 按1∶3的比例分种细胞传代培养 ， 每3天用含10%新生牛血清的dmem换液1次 。实验用第5～12代细胞 。
3.细胞胶原凝胶的制作：
①将第5～12代处于指数生长期的包皮成纤维细胞分别用0.25%胰蛋白酶消化后制成悬液 ， 计数 ， 调整细胞悬液浓度为1.5×10５个细胞/ml ， 取4ml细胞悬液离心 ， 弃培养基 ， 加入新生牛血清0.5ml 。
②吸4ml鼠尾胶原溶液放入冰浴中的青霉素小瓶中 ， 加入0.5ml浓缩10倍的dmem培养基 ， 及时混匀 ， 平衡温度后加入0.1ml 1n naoh以中和醋酸 ， 快速混匀 ， 确定ph为7.4左右后立即加入新生牛血清细胞悬液 ， 快速混合 ， 然后吸到24孔板中 ， 每孔加0.8ml ， 共6孔；静置10分钟内便很快形成细胞凝胶 ， 加入10%新生牛血清dmem培养基进行培养 ， 每周换液2次 。试验重复3次 。每日观察细胞
的形态和收缩情况 。
4.组织学检查：细胞凝胶块培养1～3周后进行组织学检查 ， 用bouin液固定24小时 ， 常规组织切片 ， 切片4μm厚 ， he染色 ， 镜下观察 。
二、结果
(一)细胞的形态与分布：成纤维细胞胶原凝胶形成后呈半透明状态 ， 随着细胞密度的增加 ， 透明度稍降低 ， 其质地与颜色近似真皮组织 ， 有一定的弹性和抗拉性 ， 不易碎 ， 因此凝胶可以被握持搬动 。当凝胶与培养皿壁分离后则凝胶块收缩如圆盘状飘浮在培养基的液面下 ， 在倒置显微镜下可清楚地看到凝胶中各个层次的细胞及形态 。接种后成纤维细胞在凝胶中的位置是相对固定的 ， 并不象在普通培养基中那样迅速贴壁 ， 说明此时成纤维细胞已经粘附在胶原支架上 ， 约2小时后经胰酶消化后呈圆形的成纤维细胞表面逐渐伸展延长 ， 形成2个以上的胞质突起 ， 有的似星状 ， 表明成纤维细胞已存活生长 ， 开始与胶原发生粘着 。随着培养天数的增加 ， 这些突起在细胞的两极逐渐伸展延长 ， 但突起数目逐渐减少 ， 最后在细胞的两极形成两个较长的突起而成梭形 。而且随着细胞凝胶的收缩 ， 平行排列的细胞变得愈加致密 ， 有时互相交织呈网络状 。当细胞密度达到其极限后(大约培养2～3周后) ， 成纤维细胞可以象组织块中的成纤维细胞一样从胶原凝胶中迁出 ， 导致细胞凝胶的贴壁生长 。而细胞凝胶块可以一直培养3个月以上 。
(二)组织切片：培养2周后细胞凝胶做组织切片观察发现胶原呈较均一的淡红色 ， 而成纤维细胞均匀地分布于胶原中 ， 呈梭形 ， 大多数细胞有的两极为两个较长的突起 ， 极少数细胞有较多的突起 ， 细胞较小 ， 胞核呈椭圆形 ， 胞浆少 。
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