银屑病是一种常见的炎性增生性皮肤病 ， 尽管其发病机理目前尚不清楚 ， 但表达hla-2、白介素2(il-2)受体等活化标志的t淋巴细胞在发病中的作用愈来愈受到人们的关注 ， 局部浸润激活的t淋巴细胞一方面产生大量的生长因子/细胞因子 ， 通过旁分泌作用于角质形成细胞直接刺激表皮增生；另一方面通过影响代谢 ， 发挥促增生作用[1] 。t淋巴细胞激活伴有酪氨酸残基的磷酸化 ， 酪氨酸蛋白激酶(tpk)在淋巴细胞激活、分化调控中具有重要的生理功能[2] 。我们通过对银屑病外周血t淋巴细胞tpk活性的研究 ， 以探讨tpk在t淋巴细胞异常激活中的作用 ， 为银屑病发病机理和治疗的研究提供一定的依据 。
【银屑病患者外周血T淋巴细胞酪氨酸蛋白激酶活性的初步研究】
文章插图
一、材料和方法
1.标本来源：进行期寻常型银屑病22例 ， 男13例 ， 女9例 ， 年龄18～45岁 ， 平均年龄28.4岁；17例正常人对照组 ， 男10例 ， 女7例 ， 年龄22～41岁 ， 平均年龄26.3岁 。两组性别、年龄无统计学差异 。常规采取10ml全血加入柠檬酸钠抗凝 。
2.t淋巴细胞膜制备[3]：全血用淋巴细胞分离液提取淋巴细胞 ， 再通过尼龙毛纯化出t淋巴细胞 。加入刀豆素a(cona)(每1×106t淋巴细胞加入20μg/ml) ， 37℃、5％ co2孵箱内分别孵育0h、2h、4h、8h 。将t淋巴细胞置于匀浆液内(50mmol/l tris ， ph7.4 ， 1mmol/l egta ， 1.5mmol/l mgcl2 ， 100mmol/l naf ， 0.5mmol/l pmsf ， 250mmol/l庶糖 ， 5mmol/l dtt) ， 冰水浴内匀浆破膜 ， 1000r/min离心10min ， 上清液再100 000r/min、4℃离心90min ， 放入－70℃冰箱内保存 。1个月内测定tpk活性 。
表1 银屑病患者t淋巴细胞膜酪氨酸蛋白激酶活性(±s ， fmol．mg-1蛋白)
组 别例 数基础状态cona刺激2h4h8h对照组1766.87±21.34121.03±13.60258.22±30.45252.27±32.45银屑病2225.05±8.6267.14±6.05250.63±39.23339.84±42.07t值-8.073.471.067.31p值-＜0.01＜0.01＞0.05＜0.01 3.t淋巴细胞膜tpk活性测定[3]：反应体系总体积50μl ， 含终浓度为20mmol/l tris-hcl ， ph7.0 ， 50mmol/l mgcl2 ， 25μmol/l正矾酸钠 ， 0.1％ triton x-100 ， polyglu∶tyr(4∶1)1mg/ml ， 膜蛋白10μg ， 反应以加入[γ-32p]-atp(0.4μci/管)启动 ， 30℃反应5min 。加入10μl 0.5mol/l edta ， ph8.0 ， 终止反应 ， 对照管终止反应时加入polyglu∶tyr(4∶1) 。每个反应平行3管 。取反应液40μl点样于0.22μm微孔滤膜 ， 以10％三氯醋酸负压抽滤 ， lklb-127型液体闪烁机计数 。tpk的活性以每mg膜蛋白每分钟催化32p转入到多聚谷酪氨酸(4∶1)的fmol数减去自磷酸化的tpk活性值来表示 。
4.统计学处理：采用第三军医大学数学教研室编制的《医用统计程序包spmr》中的t检验 。
二、结果
在基础状态下 ， 正常人外周血t淋巴细胞tpk活性(66.87)显著高于银屑病组(25.05)(p＜0.01)；当用cona分别孵育2h、4h、8h ， t淋巴细胞膜tpk活性呈现时间依赖性增高 ， 但银屑病组反应明显强于正常人组 ， 4h已基本达到至正常人水平 ， 8h显著高于正常人对照组(p＜0.01) 。
三、讨论
tpk系统在淋巴细胞的免疫激活中具有重要的作用 。本实验结果发现 ， 在基础状态下 ， 银屑病外周血t淋巴细胞tpk活性显著降低 ， t淋巴细胞tpk活性的降低将直接影响细胞免疫功能 ， 这可能是引起银屑病中细胞免疫功能低下的重要原因 。研究发现银屑病外周血中存在一种能在体外抑制正常人t淋巴细胞形成花环的因子 ， 它与t细胞上cd2(即e花环受体)结合后 ， 可使淋巴细胞功能低下[4] ， 但是否cd2分子的封闭是引起tpk活性降低的主要原因仍需进一步研究 。cona与t细胞具有高度亲合性 ， 可使t细胞表面的e花环受体恢复或使阻断因子从细胞表面脱落 。许桦等[5]发现随着孵育时间延长 ， t细胞e花环形成率逐渐增高 ， 8h完全恢复正常 。本研究结果示经过cona孵育后 ， t淋巴细胞的tpk活性呈时间依赖性增高 ， 4h已经达到正常 ， 8h显著增高 ， 推测可能是由于：1cd2功能的恢复 ， 启动旁路激活途径；2银屑病t淋巴细胞存在多种tpk的活性增高 ， 增高的tpk活性催化更多底物酪氨酸磷酸化；3tpk的负调节剂蛋白酪氨酸磷酸化酶的活性发生改变 。对cona刺激的不同反应提示银屑病中t细胞的tpk系统不同于正常人 。
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